เอนไซม์

เอนไซม์
ในกระบวนการหมักบูดูเอนไซม์เข้ามามีบทบาทอย่างมากในการย่อยสลายโปรตีนและไขมัน ซึ่งเอนไซม์เหล่านี้อยู่ในตัวปลาอยู่แล้ว หรืออาจจะติดมากับสิ่งแวดล้อม เช่น เกลือ เป็นต้น กล่าวคือหลังจากปลาตาย เอนไซม์จากอวัยวะส่วนต่างๆ ของปลา โดยเฉพาะบริเวณลำไส้จะออกมาทางช่องท้อง แล้วไปยังกล้ามเนื้อปลา ทำให้เกิดการย่อยสลายเนื้อปลา (Autolysis) ได้อย่างรวดเร็ว ระดับและชนิดของเอนไซม์โปรติเอสจะแตกต่างกันไปตามส่วนต่างๆ ของตัวปลา สำหรับเอนไซม์โปรติเอสภายในตัวปลาสามารถแบ่งได้เป็น 2 กลุ่ม คือ 1.เอนไซม์ในเครื่องในปลาและทางเดินอาหารได้แก่ ทริปซิน ไคโมทริปซิน และเปปซิน 2.เอนไซม์ในเนื้อเยื่อ ได้แก่ คาเทปซิน มีผู้ที่ศึกษาเอนไซม์ในตัวปลา ซึ่งพอสรุปได้ดังนี้ ในปลาซาร์ดีนจะมีปริมาณเอนไซม์โปรติเอสในไส้ติ่งมากกว่าในกระเพาะอาหาร แต่โดยทั่วไปแล้วเอนไซม์โปรติเอสที่อยู่ภายในระบบทางเดินอาหารจะมีประสิทธิภาพดีกว่าเอนไซม์โปรติเอสในกล้ามเนื้อ โดยเฉพาะเอนไซม์ในกระเพาะอาหารซึ่งจะเปลี่ยนแปลงตามฤดูกาลและปริมาณอาหารด้วย เอนไซม์ที่ได้จากการสกัดเครื่องในปลาคอด (cod) ประกอบด้วย ทริปซิน (trypsin) ไคโมทริปซิน (chymotrypsin) และอีลาสเทส (elastase) นอกจากนี้ยังมีเอนไซม์ย่อยแป้งและย่อยไขมันในปริมาณต่ำ เปปซิน (pepsin) เป็นเอนไซม์ที่ได้จากน้ำย่อยในกระเพาะปลา และทริปซินเป็นเอนไซม์ที่ได้จากไส้ติ่งของปลา เอนไซม์คาเทปซิน (cathepsin) จะทำงานได้ดีที่สุดที่พีเอช 4.3 เอนไซม์ทริปซินจะคงตัวในสภาพกรดมากกว่าเบส แต่ทำงานได้ดีที่สภวะเบส อุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับเอนไซม์จากเครื่องในปลาคือ 34-45 องศาเซลเซียส เอนไซม์เป็นกลุ่มโมเลกุลโปรตีนที่มีหน้าที่พิเศษแตกต่างจากโปรตีนและโมเลกุลขนาดใหญ่ทั่วไปกล่าวคือ มีความสามารถเร่งปฏิกิริยาเคมี (catalytic activity) ในสิ่งมีชีวิตได้อย่างมีประสิทธิภาพสูงกว่าตัวเร่งสังเคราะห์เป็นหลายล้านเท่า นอกจากนี้เอนไซม์สามารถทำงานได้ภายใต้ภาวะไม่รุนแรงซึ่งเหมาะสมอย่างยิ่งกับสภวะภายในเซลล์สิ่งมีชีวิต เอนไซม์มีความจำเพาะต่อสับสเตรตสูงมาก และเร่งปฏิกิริยาโดยไม่ทำให้เกิดผลิตภัณฑ์อื่น รวมทั้งเอนไซม์เพิ่มอัตราเร็วของปฏิกิริยาโดยเอนไซม์มีความสามารถในการกระตุ้น ทำให้พลังงานกระตุ้นของปฏิกิริยาลดลง สมบัติของเอนไซม์ เอนไซม์เป็นโปรตีน (Protien) แสดงได้จากปรากฏการณ์ดังนี้ 1.เมื่อนำเอนไซม์มาย่อยสลาย (hydrolysis) ด้วยกรดไฮโดรคลอริก โซดาไฟ หรือเอนไซม์โปรติเอส จะพบว่าผลผลิตที่ได้ประกอบด้วยกรดอะมิโน บางครั้งอาจพบกลุ่มคาร์โบไฮเดรต (glyco), ฟอสเฟต, กรดนิวคลีอิก, หรือไขมัน 2. เอนไซม์ถูกทำให้เสียสภาพธรรมชาติของโปรตีน (protein denaturation) ได้ด้วยความร้อน, สารละลายอินทรีย์, กรดแก่หรือเบสแก่เหมือนโปรตีนทั่วไป 3.เเอนไซม์มีลักษณะเหมือนโปรตีนอื่นๆ เมื่อนำมาศึกษา X-ray crystallography เอนไซม์เป็นตัวเร่ง (Catalytic activity) เอนไซม์ทุกตัวจะมีผลให้อัตราเร็วของปฏิกิริยาเพิ่มขึ้น (positive catalytic activity) โดยเพิ่ม turnover number 10(2)-10(7) เท่า ค่า turnover number แสดงให้เห็นประสิทธิภาพในการทำงานของเอนไซม์ซึ่งหมายถึง ปริมาณเป็นโมล (mole) ของสับสเตรตที่เข้าทำปฏิกิริยากับเอนไซม์ 1 โมล ภายในหนึ่งหน่วยเวลา (มักจะเป็น 1 นาทีหรือ 1 วินาที) ทั้งนี้ขึ้นกับ pH อุณหภูมิ และปัจจัยอื่นๆ ด้วย เอนไซม์มีความจำเพาะ (Specificity) เอนไซม์มีความจำเพาะต่อสับสเตรตสูงมาก สับสเตรตจะต้องมีโครงสร้างที่เหมาะสมรวมกันพอดี (complementary) กับเอนไซม์ตรงบริเวณเร่ง (active site) เหมือนลูกกุญแจกับแม่กุญแจ หรือสามารถชักนำให้เกิดการรวมกันขึ้นได้ (Lock and key fit or induce fit) และสามารถเร่งปฏิกิริยาโดยไม่ทำให้เกิดผลิตภัณฑ์อื่น (by-products) เอนไซม์จะต้องจับกับสับสเตรตก่อนจึงจะเกิดการเร่ง (catalysis) ได้ เอนไซม์มีความสามารถในการกระตุ้น (Activation) เอนไซม์เพิ่มอัตราเร็วของปฏิกิริยาโดยลดพลังงานกระตุ้นของปฏิกิริยา ตามทฤษฎี Transision state ได้อธิบายขั้นตอนการเกิดปฏิกิริยาเคมีทั่วๆ ไปว่าตัวทำปฏิกิริยา (reaction) จะเปลี่ยนเป็นผลิตภัณฑ์ จะเกิดได้ก็ต่อเมื่อโมเลกุลของสับสเตรตรับพลังงานกระตุ้น (activation energy) ซึ่งจะเปลี่ยนเป็น ผลิตภัณฑ์ต่อไป อัตราเร็วของปฏิกิริยาใดๆ จึงขึ้นกับความเข้มข้นของสารนั้นที่ transition state เอนไซม์จะลดพลังงานกระตุ้นของปฏิกิริยามีผลให้เพิ่มอัตราเร็วของปฏิกิริยาเคมีในเซลล์สิ่งมีชีวิตได้ สิ่งมีชีวิตทั้งหลายไม่ว่าพืช สัตว์ หรือจุลินทรีย์ ทุกกระบวนการของสิ่งมีชีวิตทุกประเภทมีเอนไซม์เป็นองค์ประกอบสำคัญทั้งสิ้น เอนไซม์ทำหน้าที่ในการสังเคราะห์แสงเพื่อการเจริญการร่วงของดอกใบของพืช การย่อยอาหาร การผลิตพลังงานควบคู่ไปกับการนำพลังงานที่ได้ไปสร้างสารพลังงาน การสลายอาหารโมเลกุลใหญ่ในเซลล์สัตว์ชั้นสูงล้วนเป็นผลจากปฏิกิริยาที่มีเอนไซม์เป็นตัวเร่ง เอนไซม์จึงมีความสำคัญในด้านต่างๆ เช่น ด้านโภชนาการ เอนไซม์มีความสำคัญเกี่ยวข้องกับการย่อยอาหารซึ่งเป็นปฏิกิริยาเคมีที่ทำงานต่อเนื่องกันอย่างมีระเบียบเพื่อสลายโมเลกุลของสารอาหารให้ได้เป็นสารโมเลกุลเล็ก และมีการปล่อยพลังงานออกจากสารอาหารเหล่านั้นควบคู่ไปกับการนำพลังงานที่ได้ไปสร้างสารพลังงานพร้อมกับสังเคราะห์องค์ประกอบต่างๆ ภายในเซลล์เพื่อการเจริญเติบโตในขั้นตอนต่อไปของเซลล์สิ่งมีชีวิต ควมจำเพาะของเอนไซม์ (Enzyme specificity) 1890-1930 Emil Fisher เสนอทฤษฎี "lock and key" ซึ่งมีพื้นฐานจากการเกิด "stereospecific enzyme-substrate complex" โดยโครงสร้างของเอนไซม์เปรียบได้กับแม่กุญแจ (lock) และสับสเตรตเปรียบได้กับลูกกุญแจ (key) ซึ่งจะสวมกันได้อย่างเหมาะสมพอดี (complementary) ในขณะที่เกิด ES-complex ส่วนของสับสเตรตที่ทำหน้าที่จับกับเอนไซม์ (binging group, BG) จะจับกับ binding site (BS) ของเอนไซม์ทำให้ reative group (RG) ของสับสเตรตที่จะเข้าทำปฏิกิริยาอยู่ตรงบริเวณเร่ง (catalytic site, CS) ของเอนไซม์พอดี โดยที่โครงสร้างและโครงแบบ (conformation) ทั้งหมดของเอนไซม์และสับสเตรตไม่เปลี่ยนแปลง 1958 Koshland เสนอสมมติฐาน Koshland "induced fit" เขาเสนอว่าสับสเตรตเมื่อจับกับเอนไซม์จะสามารถเหนี่ยวนำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงโครงแบบ (conformation) หรือโครงสร้างของเอนไซม์ได้ จึงเปรียบสับสเตรตเหมือนมือ และเอนไซม์เหมือนถุงมือ ซึ่งเมื่อสวม ถุงมือจะเปลี่ยนรูปร่างไปให้เหมาะสมกับมือได้ ตัวยับยั้ง (Inhibitor) หมายถึง สารประกอบเมื่อเติมลงไปในปฏิกิริยาที่มีเอนไซม์เป็นตัวเร่งแล้วทำให้อัตราเร็วของปฏิกิริยาช้าลง สารหลายตัวมีสมบัติการทำงานของเอนไซม์ที่ขั้นตอนใดขั้นตอนหนึ่ง ตัวยับยั้งอาจทำปฏิกิริยากับเอนไซม์ที่บริเวณจับ (binding site) หรือบริเวณเร่ง (catalytic site) แล้วทำให้สับสเตรตไม่สามารถจับกับเอนไซม์ได้ตามเดิม หรือหากจับได้ปฏิกิริยาก็ไม่สามารถดำเนินได้ตามปกติ ไขมัน การเปลี่ยนแปลงทางชีวเคมีเมื่อปลาตาย บัพเฟอร์ กระบวนการเกิดสี และกลิ่นของบูดู กระบวนการออสโมซิส การเปลี่ยนแปลงทางจุลชีววิทยา การเปลี่ยนแปลงทางกายภาพ เอนไซม์ การนำความรู้ทางวิทยาศาสตร์มาประยุกต์ในการผลิตบูดู โปรตีน

เอนไซม์

ในกระบวนการหมักบูดูเอนไซม์เข้ามามีบทบาทอย่างมากในการย่อยสลายโปรตีนและไขมัน ซึ่งเอนไซม์เหล่านี้อยู่ในตัวปลาอยู่แล้ว หรืออาจจะติดมากับสิ่งแวดล้อม เช่น เกลือ เป็นต้น กล่าวคือหลังจากปลาตาย เอนไซม์จากอวัยวะส่วนต่างๆ ของปลา โดยเฉพาะบริเวณลำไส้จะออกมาทางช่องท้อง แล้วไปยังกล้ามเนื้อปลา ทำให้เกิดการย่อยสลายเนื้อปลา (Autolysis) ได้อย่างรวดเร็ว ระดับและชนิดของเอนไซม์โปรติเอสจะแตกต่างกันไปตามส่วนต่างๆ ของตัวปลา สำหรับเอนไซม์โปรติเอสภายในตัวปลาสามารถแบ่งได้เป็น 2 กลุ่ม คือ
1.เอนไซม์ในเครื่องในปลาและทางเดินอาหารได้แก่ ทริปซิน ไคโมทริปซิน และเปปซิน
2.เอนไซม์ในเนื้อเยื่อ ได้แก่ คาเทปซิน
มีผู้ที่ศึกษาเอนไซม์ในตัวปลา ซึ่งพอสรุปได้ดังนี้ ในปลาซาร์ดีนจะมีปริมาณเอนไซม์โปรติเอสในไส้ติ่งมากกว่าในกระเพาะอาหาร แต่โดยทั่วไปแล้วเอนไซม์โปรติเอสที่อยู่ภายในระบบทางเดินอาหารจะมีประสิทธิภาพดีกว่าเอนไซม์โปรติเอสในกล้ามเนื้อ โดยเฉพาะเอนไซม์ในกระเพาะอาหารซึ่งจะเปลี่ยนแปลงตามฤดูกาลและปริมาณอาหารด้วย เอนไซม์ที่ได้จากการสกัดเครื่องในปลาคอด (cod) ประกอบด้วย ทริปซิน (trypsin) ไคโมทริปซิน (chymotrypsin) และอีลาสเทส (elastase) นอกจากนี้ยังมีเอนไซม์ย่อยแป้งและย่อยไขมันในปริมาณต่ำ เปปซิน (pepsin) เป็นเอนไซม์ที่ได้จากน้ำย่อยในกระเพาะปลา และทริปซินเป็นเอนไซม์ที่ได้จากไส้ติ่งของปลา เอนไซม์คาเทปซิน (cathepsin) จะทำงานได้ดีที่สุดที่พีเอช 4.3 เอนไซม์ทริปซินจะคงตัวในสภาพกรดมากกว่าเบส แต่ทำงานได้ดีที่สภวะเบส อุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับเอนไซม์จากเครื่องในปลาคือ 34-45 องศาเซลเซียส

เอนไซม์เป็นกลุ่มโมเลกุลโปรตีนที่มีหน้าที่พิเศษแตกต่างจากโปรตีนและโมเลกุลขนาดใหญ่ทั่วไปกล่าวคือ มีความสามารถเร่งปฏิกิริยาเคมี (catalytic activity) ในสิ่งมีชีวิตได้อย่างมีประสิทธิภาพสูงกว่าตัวเร่งสังเคราะห์เป็นหลายล้านเท่า นอกจากนี้เอนไซม์สามารถทำงานได้ภายใต้ภาวะไม่รุนแรงซึ่งเหมาะสมอย่างยิ่งกับสภวะภายในเซลล์สิ่งมีชีวิต เอนไซม์มีความจำเพาะต่อสับสเตรตสูงมาก และเร่งปฏิกิริยาโดยไม่ทำให้เกิดผลิตภัณฑ์อื่น รวมทั้งเอนไซม์เพิ่มอัตราเร็วของปฏิกิริยาโดยเอนไซม์มีความสามารถในการกระตุ้น ทำให้พลังงานกระตุ้นของปฏิกิริยาลดลง
สมบัติของเอนไซม์
เอนไซม์เป็นโปรตีน (Protien) แสดงได้จากปรากฏการณ์ดังนี้
1.เมื่อนำเอนไซม์มาย่อยสลาย (hydrolysis) ด้วยกรดไฮโดรคลอริก โซดาไฟ หรือเอนไซม์โปรติเอส จะพบว่าผลผลิตที่ได้ประกอบด้วยกรดอะมิโน บางครั้งอาจพบกลุ่มคาร์โบไฮเดรต (glyco), ฟอสเฟต, กรดนิวคลีอิก, หรือไขมัน
2. เอนไซม์ถูกทำให้เสียสภาพธรรมชาติของโปรตีน (protein denaturation) ได้ด้วยความร้อน, สารละลายอินทรีย์, กรดแก่หรือเบสแก่เหมือนโปรตีนทั่วไป
3.เเอนไซม์มีลักษณะเหมือนโปรตีนอื่นๆ เมื่อนำมาศึกษา X-ray crystallography
เอนไซม์เป็นตัวเร่ง (Catalytic activity)
เอนไซม์ทุกตัวจะมีผลให้อัตราเร็วของปฏิกิริยาเพิ่มขึ้น (positive catalytic activity) โดยเพิ่ม turnover number 10(2)-10(7) เท่า ค่า turnover number แสดงให้เห็นประสิทธิภาพในการทำงานของเอนไซม์ซึ่งหมายถึง ปริมาณเป็นโมล (mole) ของสับสเตรตที่เข้าทำปฏิกิริยากับเอนไซม์ 1 โมล ภายในหนึ่งหน่วยเวลา (มักจะเป็น 1 นาทีหรือ 1 วินาที) ทั้งนี้ขึ้นกับ pH อุณหภูมิ และปัจจัยอื่นๆ ด้วย
เอนไซม์มีความจำเพาะ (Specificity)
เอนไซม์มีความจำเพาะต่อสับสเตรตสูงมาก สับสเตรตจะต้องมีโครงสร้างที่เหมาะสมรวมกันพอดี (complementary) กับเอนไซม์ตรงบริเวณเร่ง (active site) เหมือนลูกกุญแจกับแม่กุญแจ หรือสามารถชักนำให้เกิดการรวมกันขึ้นได้ (Lock and key fit or induce fit) และสามารถเร่งปฏิกิริยาโดยไม่ทำให้เกิดผลิตภัณฑ์อื่น (by-products) เอนไซม์จะต้องจับกับสับสเตรตก่อนจึงจะเกิดการเร่ง (catalysis) ได้
เอนไซม์มีความสามารถในการกระตุ้น (Activation)
เอนไซม์เพิ่มอัตราเร็วของปฏิกิริยาโดยลดพลังงานกระตุ้นของปฏิกิริยา ตามทฤษฎี Transision state ได้อธิบายขั้นตอนการเกิดปฏิกิริยาเคมีทั่วๆ ไปว่าตัวทำปฏิกิริยา (reaction) จะเปลี่ยนเป็นผลิตภัณฑ์ จะเกิดได้ก็ต่อเมื่อโมเลกุลของสับสเตรตรับพลังงานกระตุ้น (activation energy) ซึ่งจะเปลี่ยนเป็น ผลิตภัณฑ์ต่อไป อัตราเร็วของปฏิกิริยาใดๆ จึงขึ้นกับความเข้มข้นของสารนั้นที่ transition state
เอนไซม์จะลดพลังงานกระตุ้นของปฏิกิริยามีผลให้เพิ่มอัตราเร็วของปฏิกิริยาเคมีในเซลล์สิ่งมีชีวิตได้ สิ่งมีชีวิตทั้งหลายไม่ว่าพืช สัตว์ หรือจุลินทรีย์ ทุกกระบวนการของสิ่งมีชีวิตทุกประเภทมีเอนไซม์เป็นองค์ประกอบสำคัญทั้งสิ้น เอนไซม์ทำหน้าที่ในการสังเคราะห์แสงเพื่อการเจริญการร่วงของดอกใบของพืช การย่อยอาหาร การผลิตพลังงานควบคู่ไปกับการนำพลังงานที่ได้ไปสร้างสารพลังงาน การสลายอาหารโมเลกุลใหญ่ในเซลล์สัตว์ชั้นสูงล้วนเป็นผลจากปฏิกิริยาที่มีเอนไซม์เป็นตัวเร่ง เอนไซม์จึงมีความสำคัญในด้านต่างๆ เช่น ด้านโภชนาการ เอนไซม์มีความสำคัญเกี่ยวข้องกับการย่อยอาหารซึ่งเป็นปฏิกิริยาเคมีที่ทำงานต่อเนื่องกันอย่างมีระเบียบเพื่อสลายโมเลกุลของสารอาหารให้ได้เป็นสารโมเลกุลเล็ก และมีการปล่อยพลังงานออกจากสารอาหารเหล่านั้นควบคู่ไปกับการนำพลังงานที่ได้ไปสร้างสารพลังงานพร้อมกับสังเคราะห์องค์ประกอบต่างๆ ภายในเซลล์เพื่อการเจริญเติบโตในขั้นตอนต่อไปของเซลล์สิ่งมีชีวิต
ควมจำเพาะของเอนไซม์ (Enzyme specificity)
1890-1930 Emil Fisher เสนอทฤษฎี "lock and key" ซึ่งมีพื้นฐานจากการเกิด "stereospecific enzyme-substrate complex" โดยโครงสร้างของเอนไซม์เปรียบได้กับแม่กุญแจ (lock) และสับสเตรตเปรียบได้กับลูกกุญแจ (key) ซึ่งจะสวมกันได้อย่างเหมาะสมพอดี (complementary)
ในขณะที่เกิด ES-complex ส่วนของสับสเตรตที่ทำหน้าที่จับกับเอนไซม์ (binging group, BG) จะจับกับ binding site (BS) ของเอนไซม์ทำให้ reative group (RG) ของสับสเตรตที่จะเข้าทำปฏิกิริยาอยู่ตรงบริเวณเร่ง (catalytic site, CS) ของเอนไซม์พอดี โดยที่โครงสร้างและโครงแบบ (conformation) ทั้งหมดของเอนไซม์และสับสเตรตไม่เปลี่ยนแปลง

1958 Koshland เสนอสมมติฐาน Koshland "induced fit" เขาเสนอว่าสับสเตรตเมื่อจับกับเอนไซม์จะสามารถเหนี่ยวนำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงโครงแบบ (conformation) หรือโครงสร้างของเอนไซม์ได้ จึงเปรียบสับสเตรตเหมือนมือ และเอนไซม์เหมือนถุงมือ ซึ่งเมื่อสวม ถุงมือจะเปลี่ยนรูปร่างไปให้เหมาะสมกับมือได้
ตัวยับยั้ง (Inhibitor) หมายถึง สารประกอบเมื่อเติมลงไปในปฏิกิริยาที่มีเอนไซม์เป็นตัวเร่งแล้วทำให้อัตราเร็วของปฏิกิริยาช้าลง สารหลายตัวมีสมบัติการทำงานของเอนไซม์ที่ขั้นตอนใดขั้นตอนหนึ่ง ตัวยับยั้งอาจทำปฏิกิริยากับเอนไซม์ที่บริเวณจับ (binding site) หรือบริเวณเร่ง (catalytic site) แล้วทำให้สับสเตรตไม่สามารถจับกับเอนไซม์ได้ตามเดิม หรือหากจับได้ปฏิกิริยาก็ไม่สามารถดำเนินได้ตามปกติ

     ไขมัน                                                                          การเปลี่ยนแปลงทางชีวเคมีเมื่อปลาตาย

บัพเฟอร์                                                                      กระบวนการเกิดสี และกลิ่นของบูดู

   กระบวนการออสโมซิส                                                   การเปลี่ยนแปลงทางจุลชีววิทยา

        การเปลี่ยนแปลงทางกายภาพ                                           เอนไซม์

    การนำความรู้ทางวิทยาศาสตร์มาประยุกต์ในการผลิตบูดู       โปรตีน